Изотермическая титрационная калориметрия (ITC)
Безмаркерные измерения сродства связывания и термодинамических параметров биомолекулярного взаимодействия для понимания работы и механизмов взаимодействия на молекулярном уровне.
Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) — это метод, применяемый для количественных исследований широкого спектра биомолекулярных взаимодействий. Она позволяет напрямую измерить тепло, которое выделяется или поглощается в процессе связывания биомолекул.
Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) — это единственный метод, способный одновременно определить все параметры связывания за один эксперимент. Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) не требует модификации связываемых молекул посредством флуоресцентных меток и иммобилизации и измеряет сродство связывания молекул в нативной форме.
Измерение передачи тепла при связывании обеспечивает точное определение констант связывания (KD), стехиометрии реакции (n), энтальпии (∆H) и энтропии (ΔS). При этом создается полный термодинамический профиль молекулярного взаимодействия. ITC не только измеряет сродство связывания, но и может определить механизмы, лежащие в основе молекулярного взаимодействия. Более глубокое понимание взаимосвязи структур и функций позволяет принимать более надежные решения при выборе вариантов и оптимизации прототипа.
Принцип измерения
Изотермическая титрационная калориметрия предназначена для измерения параметров реакций, возникающих при взаимодействии биомолекул. Этот метод позволяет определить сродство связывания, стехиометрию, энтропию и энтальпию реакции связывания в растворе без использования маркеров.
При связывании поглощение или выделение тепла измеряется чувствительным калориметром в процессе плавного титрования лиганда в кювете для образцов, содержащей исследуемую биомолекулу.
Принцип работы
Термический центр
В микрокалориметре предусмотрены две кюветы, одна из которых содержит воду и выступает в качестве контрольной кюветы, а вторая содержит образец. Задачей микрокалориметра является поддержание одинаковой температуры в обеих кюветах. Термочувствительное устройство определяет разность температур в кюветах во время связывания и передает данные на нагреватели, которые компенсируют эту разность, обеспечивая одинаковую температуру в кюветах.
Выполнение измерения
Для контрольной кюветы и кюветы для образцов задается требуемая для проведения эксперимента температура. Лиганд загружают в шприц, установленный в высокоточное устройство ввода. Устройство ввода вставляют в кювету для образца, содержащую изучаемый белок. Ряд последовательных аликвот лиганда подается в белковый раствор. Если происходит связывание лиганда с белком, изменения температуры даже на несколько миллионных частей градуса Цельсия фиксируются и измеряются.
После первого ввода микрокалориметр измеряет все выделенное тепло, пока реакция связывания не придет к равновесию. Полученное в результате измерения количество тепла находится в прямой зависимости от объема связывания.
Анализ результатов и данных
В примере ниже приведена экзотермическая реакция, что означает, что кювета для образца стала теплее, чем контрольная кювета, что привело к появлению нижнего пикового значения сигнала. Когда температура в двух кюветах снова становится одинаковой, сигнал возвращается к исходному значению. Вторая маленькая аликвота лиганда вводится в ту же кювету, после чело калориметр снова выполняет компенсацию небольшого изменения температуры. Молярное соотношение лиганда и белка постепенно увеличивается в результате последовательных вводов лиганда. Белок становится все более насыщенным, связывание с лигандом сокращается, и теплообмен начинает снижаться до момента, когда количество лиганда в кювете для образца не окажется избыточным по отношению к белку, в результате чего реакция будет смещаться в сторону насыщения.
Затем площадь каждого пика будет интегрирована и отражена на графике молярного соотношения лиганда и белка. Получившаяся в результате изотерма может быть совмещена с моделью связывания, из которой было получено значение сродства (KD). Молярное соотношение в центре изотермы связывания дает нам значение стехиометрии реакции. График, приведенный ниже, является примером реакции связывания с соотношением 1:1.
Энтальпия (ΔH) также возникает при совмещении изотермы и количества выделенного тепла на один моль связанного лиганда. Это означает, что за один эксперимент с применением изотермической титрационной калориметрии (ITC) можно получить большое количество информации о реакции связывания, что помогает понять природу взаимодействия и исследовать термодинамические факторы.
Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) широко используется при открытии и разработке лекарственных препаратов для следующих задач:
- Количественная оценка сродства связывания
- Подбор и оптимизация потенциальных препаратов
- Измерение термодинамических параметров и активной концентрации
- Характеризация механизма действия
- Подтверждение намеченных целей связывания при исследовании низкомолекулярных препаратов
- Определение специфики и стехиометрии связывания
- Валидация значений IC50 и EC50 во время составления списка потенциальных препаратов
- Измерение кинетических параметров ферментов
